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實驗概要
從土壤微生物中提取總DNA并純化，高質(zhì)量的DNA可用于后續(xù)文庫構(gòu)建。
主要試劑
TENP緩沖液（50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0）
PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）
DNA提取緩沖液（100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0）
蛋白酶K（25 mg/mL）
溶菌酶（50 mg/mL, pH 8. 0）
20% SDS
氯仿
異戊醇
異丙醇
70%乙醇
RNAse 20 mg/mL
QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒（Qiagen）
主要設(shè)備
50mL、1.5 mL離心管
搖床
高速離心機(jī)
水浴鍋
電泳槽
電泳儀
MixMax漩渦振蕩器
實驗材料
土壤樣品
實驗步驟
1. 總DNA提取：
（1） 取2 g土樣，置于50mL滅菌的離心管中；
（2） 加入10 mL TENP緩沖液（50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0）懸浮土樣，200轉(zhuǎn)搖床振蕩10min充分混勻；
（3） 10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌多次至上清基本為無色；
（4） 用5 mL PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）漂洗一次；
（5） 沉淀加入13.5 mL DNA提取緩沖液（100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0），混勻后加入100 μL蛋白酶K（25 mg/mL）和200 μL溶菌酶（50 mg/mL, pH 8. 0），37℃水浴30 min，每隔10 min顛倒混勻；
（6） 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min顛倒混勻；
（7） 8 000 r/min室溫離心15 min，取上清，用等體積氯仿:異戊醇（24:1）抽提一次；
（8） 水相中加入0.6倍體積的異丙醇，4℃沉淀一夜；
（9） 11 000 r/min 4℃離心20 min收集DNA沉淀；
（10） 70%乙醇漂洗兩次，干燥后用100 μL ddH2O（含RNAse 20 mg/mL）溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。
2. 總DNA純化：
（1） 配制0.8%瓊脂糖凝膠；
（2） 每個上樣孔加入50 μL粗DNA，進(jìn)行低電壓長時間電泳（4℃, 25 V, 8 h）；
（3） 電泳結(jié)束后，切下主帶所在的凝膠（膠的體積盡可能小）；
QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒（Qiagen）回收：加入3倍體積的Buffer QXⅠ及適量的QIAXⅡ（Glassmilk），55℃溫浴10 min，每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀（回收大片段時不要渦旋），待凝膠*溶解，12 000 g離心1 min，棄上清；再加入500 μL Buffer QXⅠ洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠；再用500 μL Buffer PE洗滌沉淀2次，將沉淀晾干，加入適當(dāng)體積的ddH2O，離心后收集上清，瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。
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